Ácido fosfotúngstico
Instrucciones para ácido fosfotúngstico
Aplicación
El ácido fosfotúngstico se usa como marcador negativo para la revisión de pequeños componentes de tejido aislado subcelular, partículas de virus, flagelos y pelos y moléculas de proteína, etc. Esta técnica hace uso del principio de rodear las partículas con material denso en electrones dejándolas transparentes a los electrones de manera que se puede ver una imagen negativa de la geometría estructural. Este efecto de contraste invertido fue reportado primero por FARRANT (1954) cuando examinaba moléculas de ferritin y por HALL (1955) usando
partículas de virus.
Las ventajas del marcado negativo son triples:
1) La técnica es simple y rápida
2) Se obtiene un elevado contraste de electrones y buena preservación estructural.
3) Se necesitan muy pequeñas cantidades de muestra.
Procedimiento
Hay dos métodos usados normalmente para preparar muestras marcadas negativamente para microscopía electrónica.
1) BRENNER et. al. (1959). Se prepara una solución al 2% de tintura y se ajusta su PH, para igualar a la muestra, ya sea con NaOH o HCI.
Se mezcla un apequeña cantidad de la muestra con un volumen igual de la tintura y una pequeña gota de la mezcla es o bien colocada sobre una rejilla de carbón o plástico recubierto E.M., usando una pipeta Pasteur o rociada sobre la rejilla recubierta usando un nebulizador de vidrio. El exceso de líquido es removido con el borde de un papel filtro y se deja secar la rejilla.
2) Una gota de la mezcla se coloca en un E.M. recubierto, antes que se seque se remoja con una o dos gotas de tintura de la pipeta. De nuevo, se quita el exceso con un papel filtro y la reja es secada.-
En cada uno de estos métodos es necesario experimentar con la
concentración de la muestra para obtener una distribución satisfactoria de partículas en la imagen.
Para detalles más específicos de la técnica, vea KAY (1965) y HAYAT (1972).
Referencias
FARRANT J.L. (1954) Un Microscopio electrónico, estudio de Ferritin. Bioquímica, Biofísica Acta 13, 569.
HALL C.E. Partículas.(1955) Densitometría electrónica de partículas marcadas de virus . J. Bioquím., biofìs. Cytol 1, 1.
BRENNER S. y R. W. HORNE (1959) Un método de marcado negativo, para
microscopía electrónica de alta resolución de virus. Bioquímica, Biofísica Acta 34, 103.
KAY D.H. (1965) ed. Técnicas de microscopía electrónica (Capítulo 11 por R.W. Horne)' Blackwell Scientific Press.
HAYAT M.A. Microscopy.(1972) ed. Principios y técnicas de aplicaciones
electrónicas biológicas. Van Nostranol Princeton.
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Sunday May 20, 2012
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